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山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)試劑盒說明書微量法
更新時間:2023-10-31 點擊量:982

貨號:  YJS2392                                               規(guī)格:100管/96樣

山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

SDH(EC 1.1.1.14)催化山梨醇脫氫生成果糖,是調(diào)控生物體內(nèi)山梨醇含量的關(guān)健酶之一。

測定原理:

SDH催化山梨醇脫氫生成果糖,同時還原NAD+生成NADH,測定340nm吸光度增加速率可以計算SDH活性。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制:

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,

加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

3、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

1)在試劑二中加入7.6mL試劑一和11.4mL蒸餾水充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;用不完的試劑4℃保存一周;

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二,混勻,立即記錄340nm

20s時的吸光值A(chǔ)1和2min20s后的吸光值A(chǔ)2,計算ΔA=A2-A1。

SDH 活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)SDH 活力的計算

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min/mL)= [ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SDH 活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T

=1608×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.216×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清(漿)SDH 活力的計算

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min /mL)= [ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SDH 活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T

=3216×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=3216×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=6.426×ΔA

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm;d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。

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