幾種 HRP 常見(jiàn)底物及其操作

底物范圍較廣，包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

二氨基聯(lián)苯胺／金屬鹽
DAB是辣根過(guò)氧化物酶最敏感、常用的底物。它產(chǎn)生強(qiáng)烈的棕色產(chǎn)物，在水和醇中不溶解。多數(shù)情況下，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當(dāng)加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中，辣根過(guò)氧化物酶可以更加敏感。此類反應(yīng)產(chǎn)物呈暗藍(lán)灰色至黑色，且在水及醇中穩(wěn)定。DAB／金屬鹽染色應(yīng)用的組織染色范圍較廣。

   1．需要的溶液和特殊設(shè)備
   DAB，0．05mol／LTris緩沖液(pH7．6)；
   0．3％(W／V)氯化鎳／水貯存液；
   30％過(guò)氧化氫；
   DPX。
   光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)
   2．操作步驟
   (1)用9ml 0．05mol／L Tris緩沖液(pH7．6)溶解6mgDAB；
   (2)加lml 0．3％(W／V)氯化鎳／水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代)；
   (3)加0．1 m1 3％過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫一般以30％的溶液提供，貯存在4E，此條件可以持續(xù)1個(gè)月；
   (4)如果出現(xiàn)沉淀，用濾紙過(guò)濾；
   (5)加此溶液至標(biāo)本，并孵育1—20min水洗終止反應(yīng)；
   (6)優(yōu)化：如果需要可復(fù)染；
   (7)用DPX封片。

氯萘酚
   氯萘酚可以形成一種藍(lán)黑色產(chǎn)物。敏感性低于DAB，且產(chǎn)物可溶于醇中。它適用于當(dāng)DAB反應(yīng)形成較高背景或要求改變產(chǎn)物的顏色。

   1.需要的溶液和特殊設(shè)備
   0，03％氯萘酚，用無(wú)水乙醇溶解(貯存在-20℃)，0．05mol／LTris(pH7．6)
   過(guò)氧化氫；
   Gelvatol或者M(jìn)owiol。
   光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。

   2．操作步驟
   (1)氯萘酚貯存液的準(zhǔn)備：用10ml無(wú)水乙醇溶解0．3g氯萘酚，貯存于—20℃；
   (2)加100ul氯萘酚貯存液至10ml 0．05mol／LTris(pH7．6)，
   (3)加0．1ml 3％過(guò)氧化氫于水中。過(guò)氧化氫一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1個(gè)月；
   (4)白色沉淀可用濾紙過(guò)濾去除；
   (5)加此溶液到標(biāo)本中，并在室溫孵育10～40min，水洗終止反應(yīng)；
   (6)優(yōu)化：如果需要，進(jìn)行復(fù)染，但只可使用水溶性染料；
   (7)用Gelvatol或者M(jìn)owiol封片。

氨乙基咔唑
   氨乙基咔唑(AEC)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反應(yīng)產(chǎn)生較高背景或要求改變產(chǎn)物顏色的試驗(yàn)。此產(chǎn)物可溶于醇，但不溶于水。

   1．需要的溶液和特殊設(shè)備
   0．4％AEC用N，N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解；
   0．1mol／L乙酸鈉緩沖液(pH5．2)；
   過(guò)氧化氫；
   Gelvatol或Mowi01．
   光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。

   2．操作步驟
   (1)用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中穩(wěn)定，因此，可以用100mlDMF溶解0．4gAEC作為貯存液備用；
   (2)加lmlAEC溶液至15ml 0．1mol／L的乙酸鈉緩沖液(pH5．2)中，并攪拌；
   (3)加0．15ml 3％過(guò)氧化氫于水中。過(guò)氧化氫一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1個(gè)月；
   (4)用濾紙過(guò)濾；
   (5)加此溶液到標(biāo)本中，并于室溫孵育10～40min，水洗終止反應(yīng)；
   (6)優(yōu)化：如果需要復(fù)染，只可用水溶性染料；
   (7)用Gelvatol或Mowiol封片。

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